Microsatellite (SSR)에 대하여

Microsatellites 또는 simple sequence repeats (SSRs) 또는 short tandem repeats (STRs) 는 2-9 base pair의 반복되는 DNA 서열이다. 이것은 일종의 Variable Number Tandem Repeat (VNTR) 이다. Microstatellites는 일반적으로 공우성(co-dominant)이다. 이것들은 STR 분석, 친자 확인, population 연구 등에서 분자 마커로 사용된다. 또한 유전자 복사/삭제, 표지 이용 선발에 의한 작물 개량 및 fingerprinting 연구에도 사용된다.

Microstatellite의 분석

증폭(Amplification)

Microstatellite는 flanking region의 특이적인 서열을 primer로 사용하여 PCR로 증폭하여 알아낼 수 있다. DNA는 고온에서 반복적으로 변성되고 double strand는 분리 된다. 식으면 primer의 annealing이 허용되고 nucleotide 서열들이 Microstatellite를 따라서 확장된다. 이 과정은 agarose나 polyacrylamide gel에서 보이도록 충분한 DNA를 생성한다. 증폭을 하기 위해서는 오직 적은 양의 DNA가 필요한데 그 이유는 thermocycling이 복사되는 부분을 지수적으로 상승시키기 때문이다. PCR 기술 덕분에 Microstatellite loci 양 쪽의 primer를 쉽고 간단하게 사용할 수 있으나 제대로 작동하는 primer들을 만들기 위해서는 흔히 가격이 높아지고 지루한 과정을 필요로 한다.

Microstatellite primer의 제작

만약에 특정 유전체 지역 안에서 Microstatellite 마커를 찾으려고 한다면 (예를 들어 어떤 유전자의 특정 exon 안) primer는 수동적으로 디자인 될 수 있다.  Microstatellite repeat을 찾기 위해서는 눈으로 보거나, repeat masker와 같은 자동화된 도구를 사용할 수 있다. 잠재적으로 사용 가능한 Microstatellite가 결정되면, 양 옆의 서열들은 PCR reaction을 통해 특정 Microstatellite를 증폭시키는 oligonucleotide primer를 디자인 하는데 사용할 수 있다.

Random microsatellite primers는 선택한 종의 DNA에서 랜덤한 부분을 cloning 하여 개발 할 수 있다. 이러한 랜덤 부분은 plasmid 또는 bacteriophage vector에 삽입되고, 이것은 Escherichia coli 안으로 넣어 진다. Colony들이 생성되고, 만약 DNA 랜덤 부분이 포함되어 있다면 형광 표지된 oligonucleotide 서열로 스크리닝하여 microsatellite repeat과 hybridize 하게 된다. 이 과정에서 양성의 클론들이 얻어지면, DNA 서열을 읽고, 특정 유전자좌위를 결정하기 위해 양 끝 서열에서 온 PCR primer를 선택한다. 과거에 이 과정에는 많은 연구자들의 시행착오가 있었다. 그 이유는 microsatellite repeat 서열이  예측되어야 했고, 랜덤으로 분리된 primer가 현저한 다형성(polymorphism)을 보여주지 못했기 때문이다. Microsatellite loci들은 유전체 위에 널리 분포되어 있고 오래된 표본의 semi-degraded DNA에서도 분리될 수 있으며, 이 모든 것이 PCR로 증폭시킬 수 있는 적당한 요소만 있으면 된다.

최근 개발된 가술은 microsatellite repeat의 complementary repeat로 구성된 oligonucleotide sequence를 사용하여 추출된 DNA를 풍성하게 한다 (Microsatellite enrichment). Oligonucleotide probe는 microsatellite의 repeat과 hybridize되고, 이 probe/mcirosatellite complex는 용액에서 분리된다. 농축된 DNA는 정상적으로 클로닝 되지만 성공적인 비율이 많이 올라가고 증폭에 사용할 지역을 개발하는데 필요한 시간을 엄청나게 줄일 수 있다. 그러나 어떤 probe를 사용할지에는 시행착오가 필요하다.

Microstatellite의 한계

Microstatellite는 특별히 population 분석에 있어 다재 다능한 분자 마커로 입증 되었지만, 제한이 없지는 않다. 특정 종을 위해 개발된 Microstatellite는 종종 근연종에도 적용할 수 있지만, genetic distance가 늘어날 수록 성공적으로 증폭이 되는 유전자좌위(loci)의 비율은 줄어들 수 있다. 이와 같은 종의 primer annealing sites에서의 point mutation은 'null alleles'의 생성을 초래할 수 있고, 이것은 PCR에서의 microsatellite 증폭을 실패시킨다. Null allele의 원인은 여러 현상들 때문이라고 할 수 있다. Flanking region의 서열 분화는 특히 확장이 시작되는 3' section에서 나쁜 primer annealing을 초래할 수 있다. PCR의 경쟁적인 성질 때문에 특정 크기의 allele의 선택적으로 증폭되고 이것은 이형적합(heterozygous)한 개인이 동형적합(homozygosu)하게 나올 수 있게 한다 (partial null). PCR 실패는 특정 유전자좌위 증폭에 실패할 때 일어나는 반면, 다른 것들은 더욱 효율적으로 증폭되고 실제로 유전체 상에서는 이형접합이지만 gel assay에서 동형적합적으로 나 올 수 있다. Null alleles는 microsatelliote allele frequencies의 해석을 어렵게 하며 그러므로 관계된 예측들을 틀리게 한다. 더하여 교배시 일어나는 샘플링의 확률적인 효과는 null alleles의 영향과 매우 비슷하게 allele frequencies를 변화 시킬 수 있다. Null alllele가 기술적인 문제고 교배시 일어나는 sampling effect는 population의 진짜  생물학적 특징이기 때문에, 만약에 동형접합이 관찰되었다면 이들을 구별하는 게 매우 중요하다.

Microsatellite를 사용하여 종을 비교할 때, 동형접합의 유전자좌위는 근연종에서 쉽게 증폭되지만, PCR 중 증폭되는 윤전자좌위의 숫자는 종간 genetic distance가 멀어질 수록 줄어드는지는 의문이다. Microsatellite alleles에서 돌연변이는 상식적으로 더 큰 allele에 더 많은 bases가 있으므로 더 많이 있다고 할 수 있고 DNA replication이 mistranslation될 수 있게 한다. 작은 allele는 크기를 크게 할려는 경향이 있고, 큰 allele는 크기를 줄이려는 경향이 있지만 이들은 최대 크기 한계의 대상이다. 이러한 제약들이 발견되었지만, 가능한 숫자는 아직 정해지지 않았다. 만약의 각각의 alleles에서 큰 크기의 차이가 있다면, 감수분열 중 recombination이 일어날때 불안정성이 높아진다. Replication의 통제가 망가진 종양세포에서는 유사분열이 일어 날때 마다 microsatellite가 생성되거나 삭제되는 비율이 높다. 그러므로 종양세포 line은 일반적인 host tissue와 다른 genetic fingerprint를 보여 줄 것이다.

http://en.wikipedia.org/wiki/Microsatellite